Năm 1859, khi quân Pháp xâm chiếm thành Gia Định, với lòng yêu nước nồng nàn, Ông đã chỉ huy dân quân đồn điền Gia Thuận phối hợp với quân triều đình chống giặc và lập được nhiều chiến công. Một trong những chiến công nổi bật là phục kích giết chết tên đại úy thủy quân lục chiến Bạc-bê (Barbé) tại chùa Khải Tường, trừng trị những tên tay sai, tiến công giặc Pháp ở Gia Thạch, Rạch Gầm và nhiều lần đánh đồn Kỳ Hòa (Sài Gòn).
Tháng 12/1861 sau khi Đại đồn Chí Hòa thất thủ, Trương Định đưa quân về đồn cũ Tân Hòa và chiêu mộ thêm quân sĩ tiếp tục đánh Pháp. Lúc này quân số của Trương Định đã có hơn 6000 người, với sự phối hợp của nhiều lãnh tụ khởi nghĩa các vùng xung quanh. Nghĩa quân Trương Định đã lập nhiều chiến công như trừng trị nhiều tên tay sai giặc Pháp (như bá hộ Huy ở Đồng Sơn), tiến công các đồn giặc ở Gia Thạch, Rạch Gầm và nhiều lần đánh đồn Kỳ Hòa. Tháng 3/1862 khi quân Pháp rút chạy khỏi Gò Công, nghĩa quân Trương Định đã tiến công tiêu diệt nhiều tên và chiếm lại Gò Công.
Năm 1862, sau khi ký Hòa ước nhường cho thực dân Pháp đảo Côn Lôn và 3 tỉnh miền Đông Nam kỳ là Định Tường, Gia Định, Biên Hòa, triều đình nhà Nguyễn ra lệnh cho Trương Định phải giải tán nghĩa quân ở Gò Công và đi An Giang, nhận chức Lãnh binh. Theo yêu cầu của Nhân dân và các nghĩa sĩ, Trương Định khước từ lệnh triều đình và nhận danh hiệu Bình Tây Đại nguyên soái do Nhân dân phong, tiếp tục lãnh đạo cuộc kháng chiến.
Với phương thức chiến đấu là lập căn cứ ở những nơi đất đai hiểm trở, đắp nhiều thành lũy, pháo đài, tạo thành thế liên hoàn, lấy yếu đánh mạnh, lấy tinh thần dân tộc làm sức mạnh để tấn công giặc, nghĩa quân của Ông đã lập thêm nhiều chiến công như cuộc tập kích pháo hạm A-Lac-Mơ, tấn công nhiều đồn giặc và bẻ gãy cuộc tấn công quy mô của giặc Pháp như trận địa pháo trên rạch Gò Công, …nổi bật là trận tấn công Chợ Lớn - trung tâm kiểm soát của thực dân Pháp lúc bấy giờ.
Ngày 20-8-1864, do sự phản bội của Huỳnh Văn Tấn, căn cứ kháng chiến của Ông bị bao vây. Trong cuộc chiến đấu không cân sức, Ông bị trọng thương. Quyết không để rơi vào tay giặc, Ông đã dùng gươm tuẫn tiết để bảo toàn thanh danh khí tiết người anh hùng - khi ấy ông tròn 44 tuổi. Khởi nghĩa Trương Định là cuộc đấu tranh tiêu biểu nhất, có ảnh hưởng và ý nghĩa to lớn trong giai đoạn đầu của phong trào chống thực dân Pháp của Nhân dân Nam kỳ ở nửa cuối thế kỷ XIX. Trương Định là hình ảnh tiêu biểu của Nhân dân Gò Công, của Nhân dân Nam bộ bất khuất, kiên quyết chống Pháp xâm lược thế kỷ XIX.
Sau khi Trương Định mất vào ngày 20/8/1864, nhân dân mang Ông về an táng rất trọng thể nay là trung tâm thuộc thành phố Gò Công (đường Phan Đình Phùng, Phường 1). Năm 1964, ngôi mộ và đền thờ của Ông được tu bổ khang trang và giữ nguyên dáng dấp đến ngày nay. Di tích lăng mộ và đền thờ được chia làm hai phần, bao gồm phần đền thờ và phần lăng mộ, mang đậm lối kiến trúc đặc trưng của người Việt ở Nam bộ. Ngôi mộ được xây dựng bằng hợp chất ô dước (một vật liệu tạo chất kết dính) và có dáng hình voi phục. Bao quanh khu mộ là bờ tường cao 70cm, gồm 4 trụ lớn, mỗi trụ đều có hình hoa sen. Phần đền thờ, ngôi đền được xây dựng năm 1972 vừa mang dáng dấp của lối kiến trúc truyền thống phương Đông trang nghiêm, cổ kính vừa mang tính tân thời với án thờ, khuôn biển chạm trổ sơn son thiếp vàng.
Trong khu vực đền thờ có trưng bày một quyển bằng gỗ sách độc bản về tiểu sử của Trương Định và được ghi nhận là kỷ lục Việt Nam bởi giá trị lịch sử cũng như kỹ thuật tạo ra quyển sách này. Một trong những câu nói bất hủ của ông đã được khắc trong đền: “Triều đình Huế không nhìn nhận chúng ta, nhưng chúng ta cứ bảo vệ Tổ quốc chúng ta”.
Ngoài mộ và đền thờ, tại thành phố Gò Công còn có Tượng đài của ông, được tạo tác năm 1995 bằng đá hoa cương, cao 8 m, bệ bằng bê tông ốp đá cao 4 m. Đến năm 2006, tượng được thay bằng chất liệu đồng, tọa lạc tại phường 2, thị xã Gò Công, là di tích Lịch sử - Văn hóa cấp tỉnh. Hiện nay, tại thành phố Gò Công có một đường phố và một trường trung học phổ thông mang tên Ông.
Ngày 18/7/2024, Thủ Tướng chính phủ ban hành Quyết định 694-QĐ/TTg về việc xếp hạng di tích quốc gia đặc biệt đối với di tích lịch sử các địa điểm khởi nghĩa Trương Định tại thị xã Gò Công (nay thành phố Gò Công), huyện Gò Công Đông và huyện Tân Phú Đông, tỉnh Tiền Giang. Hàng năm, Lễ hội tưởng niệm Trương Định được tổ chức rất long trọng vào các ngày 19 và 20/8 tại lăng mộ và đền thờ của Trương Định ở thành phố Gò Công.
Ban Thường vụ Thành ủy, Ủy ban nhân dân thành phố quan tâm lãnh đạo, chỉ đạo các cơ quan, ban, ngành đoàn thể trên địa bàn theo chức năng, nhiệm vụ thực hiện các hoạt động tuyên truyền, giáo dục nhân kỷ niệm Ngày Anh hùng dân tộc Trương Định tuẫn tiết; tổ chức đa dạng và phong phú các hình thức để tri ân, tôn vinh vị anh hùng của dân tộc, như tuyên truyền bằng hình thức cổ động; tuyên truyền qua việc xây dựng phóng sự; qua các hoạt động về nguồn; trưng bày triển lãm về cuộc đời, sự nghiệp của Anh hùng dân tộc Trương Định và tuyên truyền trên các phương tiện thông tin đại chúng ở địa phương.
Những năm qua, việc tuyên truyền, giáo dục truyền thống lịch sử nhân kỷ niệm Ngày Anh hùng dân tộc Trương Định tuẫn tiết luôn được quan tâm sâu sắc, thông qua tổ chức các hoạt động kỷ niệm nhằm ôn lại truyền thống hào hùng vẻ vang của thế hệ cha ông trong giai đoạn đầu chống thực dân Pháp xâm lược, qua đó khẳng định ý nghĩa giá trị lịch sử của Khởi nghĩa Trương Định, tinh thần đại đoàn kết dân tộc và sức mạnh của Nhân dân.
Để phát huy truyền thống tốt đẹp về giá trị di tích Đền thờ Anh hùng dân tộc Trương Định, thành phố Gò Công xác định những công việc cần làm tốt trong thời gian tới, đó là:
- Đẩy mạnh tuyên truyền, giáo dục cho thế hệ trẻ hôm nay về tinh thần yêu nước, truyền thống tốt đẹp của dân tộc, chủ nghĩa anh hùng cách mạng; biết ơn Đảng quang vinh, Chủ tịch Hồ Chí Minh vĩ đại, sự hy sinh của đồng bào, chiến sĩ cả nước vì nền độc lập dân tộc… Khơi dậy lòng tự hào, tự tôn dân tộc đã có hàng nghìn năm dựng nước, giữ nước, đánh bại các cuộc xâm lăng của phong kiến phương Bắc và chủ nghĩa thực dân, đế quốc.
- Phát huy giá trị của các di tích lịch sử quốc gia đặc biệt là Di tích lăng mộ và đền thờ Anh hùng dân tộc Trương Định trong công tác tuyên truyền, giáo dục truyền thống cách mạng cho thế hệ trẻ hôm nay là yêu cầu cấp thiết để xây dựng, phát triển đất nước phồn vinh, hạnh phúc.
- Đoàn Thanh niên Cộng sản Hồ Chí Minh các cấp thường xuyên tổ chức các hoạt động chuyên đề về giáo dục truyền thống, có thái độ trân trọng, tình yêu quê hương, đất nước; nâng cao trách nhiệm đối với công tác, bảo tồn, phát huy giá trị di tích lịch sử, góp phần xây dựng môi trường xanh, sạch, văn minh cho các điểm di tích.
- Trang bị đầy đủ cho thế hệ thanh niên về kiến thức, tinh thần cảnh giác cách mạng, bản lĩnh vững vàng, đủ sức “đề kháng” trước những âm mưu, thủ đoạn “diễn biến hòa bình” của kẻ thù, đủ năng lực ứng phó với những thách thức “an ninh phi truyền thống” đang phổ biến hiện nay. Mỗi đoàn viên, thanh niên phải sống có mục tiêu, lý tưởng, có ước mơ, hoài bão cao đẹp, trung thực, có tinh thần cảnh giác, tuân thủ nghiêm pháp luật, kiên quyết đấu tranh chống các biểu hiện tiêu cực, tệ nạn xã hội, lối sống thực dụng, ích kỷ; chống tâm lý ngại khó, ngại khổ; thường xuyên tu dưỡng, rèn luyện, học tập, noi gương các thế hệ đi trước, góp sức xây dựng địa phương ngày càng phát triển bền vững.